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熒光顯微鏡工作原理及應用
點(diǎn)擊次數:1402 更新時(shí)間:2018-03-27
   熒光顯微鏡工作原理及應用
  熒光顯微鏡的原理和結構特點(diǎn) :熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源,經(jīng)過(guò)濾色系統發(fā)出一定波長(cháng)的光(如紫外光3650入或紫藍光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標本內的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后,再通過(guò)物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀(guān)察。這樣在強烈的對襯背景下,即使熒光很微弱也易辨認,敏感性高,主要用于細胞結構和功能以及化學(xué)成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源 、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。熒光光源——般采用超高壓汞燈(50一200W),它可發(fā)出各種波長(cháng)的光,但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生zui強熒光的激發(fā)光波長(cháng) ,所以需加用激發(fā)濾片(一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片),僅使一定波長(cháng)的激發(fā)光透過(guò)照射到標本上,而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后,在極短時(shí)間內發(fā)射出較照射波長(cháng)更長(cháng)的可見(jiàn)熒光。熒光具有專(zhuān)一性,一般都比激發(fā)光弱,為能觀(guān)察到專(zhuān)一的熒光,在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二:一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛,二是選擇并讓特異的熒光透過(guò),表現出專(zhuān)一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。
  熒光顯微鏡就其光路來(lái)分有兩種:
  1.透射式熒光顯微鏡: 激發(fā)光源是通過(guò)聚光鏡穿過(guò)標本材料來(lái)激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器,也可用普通集光器,調節反光鏡使激發(fā)光轉射和旁射到標本上.這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強,而缺點(diǎn)是隨放大倍數增加其熒光減弱.所以對觀(guān)察較大的標本材料較好。
  2.落射式熒光顯微鏡這是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡,與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面,即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器,它與光鈾呈45。角,激發(fā)光被反射到物鏡中,并聚集在樣品上,樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡,反回到雙色束分離器,使激發(fā)光和熒光分開(kāi),殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊,可滿(mǎn)足不同熒光反應產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻,成像清晰,放大倍數愈大熒光愈強。
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